Les mutations dirigées

Le terme « genome editing » regroupe un ensemble de techniques permettant d’insérer, remplacer, inhiber ou de retirer un ou plusieurs morceaux d'ADN d'un génome. Ces techniques sont plus précises que les premières techniques de génie génétique (transgenèse, cisgenèse et intragenèse), où les modifications étaient en grandes parties faites au hasard dans le génome.

Deux avancées techniques ont permis la mise au point de ces techniques:

• Le séquençage du génome permettant, à partir des années 1980, de connaître de façon précise les séquences nucléotidiques des gènes, et
• La découverte de « ciseaux » biologiques permettant de couper l’ADN à un endroit précis, les nucléases.

Les méganucléases sont des enzymes de restriction capables de reconnaitre des séquences d’environ 18 nucléotides successifs dans le génome. La probabilité de trouver sur la molécule d’ADN une autre suite de 18 nucléotides étant proche de zéro, cette méganucléase ne coupe l’ADN qu’au site ciblé. Une fois l’ADN coupé, il se répare de façon autonome suivant le même mécanisme que dans le cas des mutations spontanées. Depuis cette découverte, de nouveaux outils de modification génétique ont été utilisés :

• Les ODM (« Oligonucleotide Directed Mutagenesis ») à la fin des années 1990 (1),
• Les nucléases à doigts de zinc (ZFN, « Zinc Finger Nuclease ») au début des années 2000 (2),
• Les nucléases effectrices de type activateur de transcription TALEN (« Transcription Activator-Like Effector Nuclease ») à la fin des années 2000 (3) et,
• Depuis 2012, le système CRISPR/Cas9 (« Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ») (4). Ce dernier est généralement considéré comme unique et flexible en raison de sa dépendance à l'ARN en tant que guide qui dirige la nucléase vers une séquence d'ADN spécifique.

Contrairement aux méthodes ZFN et TALEN, qui utilisent des interactions protéine-ADN pour le ciblage, les nucléases du système CRISPR, utilisent les règles d'appariement de bases entre un guide ARN synthétisé et la séquence d'ADN cible.

 

En revanche, l'édition du génome par mutation dirigée, qui peut être appliquée selon 3 manières, est un outil avancé qui peut modifier directement la séquence nucléotidique d'une plante. 

Les techniques TALEN, CRISPR/Cas9 et ZFN suivent ce schéma. La modification génétique souhaitée est initiée en induisant des cassures double brin dans une séquence cible en utilisant des nucléases, et est ensuite atteinte par une réparation de l'ADN par NHEJ (« Non Homologous End Joining » - Voie 1) ou une réparation dirigée par recombinaison homologue (HR – « Homologous Recombination » - Voies 2 et 3). La voie NHEJ, un mécanisme non-conservatif qui ne restaure pas la séquence initiale de l'ADN; mais seulement la continuité de l'ADN endommagé, produit une petite insertion ou une délétion dans un locus spécifique sans l'utilisation d'ADN exogène. Cette réparation conduira ainsi au changement de l'information génétique. Au contraire, la voie HR peut introduire une mutation ponctuelle (Voie 2) ou un nouveau gène (Voie 3) dans un site spécifique par échange entre des molécules d'ADN identiques (homologues) ou similaires (homéologues).

 

Bien que le changement de la séquence génétique de la plante soit provoquée par l’application de techniques d’édition génétique dans le cas des mutations ciblées, il n'y a aucune trace de cette intervention - à l'exception de ces petits remodelages précisément placés, qui engendrent les propriétés désirées. Des gènes ainsi désactivés ont conduit à la résistance à des pathogènes sans avoir recours à des gènes externes (5).

 

Le « Base Editing » (édition des bases) utilise la technologie CRISPR/Cas, mais utilise une protéine Cas « morte » (dCas) qui ne peut pas scinder le double brin d’ADN, mais le déroule au bon endroit, permettant ainsi aux enzymes de modifier la base nucléotidique (6).