Mutagenèse dirigée et statut OGM

Depuis le milieu des années 1990, la culture de plantes génétiquement modifiées n'a cessé d'augmenter. Ces plantes diffèrent des variétés conventionnelles en ce sens que des gènes supplémentaires sont introduits ou que des gènes existants sont modifiés voire supprimés. En conséquence, par exemple, leurs résistances aux parasites et aux herbicides ainsi que la tolérance au stress sont accrues ou la valeur nutritive (vitamines, amidon, acides gras, …) est modifiée.

 

Le génie génétique classique commence par une manipulation extracellulaire de l'ADN pour construire un vecteur plasmidique (molécule d'ADN circulaire distincte de l'ADN chromosomique, capable de réplication autonome et non essentielle à la survie de la cellule mais qui lui confère différentes propriétés) hébergeant le gène ou la séquence d'ADN spécifique à transférer dans l'organisme choisi. Le plasmide entier ou seulement le fragment d'ADN d’intérêt est ensuite intégré dans des cellules végétales. Parmi les techniques utilisées on peut citer la biolistique (bombardement de cellules avec des particules enrobées de l’ADN à insérer) et le transfert moyennant la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Les méthodes d'ingénierie génétique laissaient généralement des traces facilement détectables dans le génome (l'ensemble du matériel génétique d'un organisme ) des plantes comme par exemple des séquences de bactéries ou de virus. Les cellules végétales modifiées sont ensuite utilisées pour régénérer une plante qui sera analysée pour les caractères recherchés.

 

Les nouvelles techniques d’édition génétique permettent d’accélérer l’obtention du caractère recherché. Ces techniques peuvent aujourd’hui produire des plantes semblables ou identiques aux plantes générées par des techniques de sélection conventionnelles, créant ainsi des limites indistinctes en ce qui concerne la réglementation des OGM.

Cadre légal et problématique des nouvelles techniques de génie génétique

En Europe, les OGM font l'objet d'un examen réglementaire impliquant une procédure d’autorisation basée sur une évaluation scientifique des risques pour la santé humaine et l'environnement. L'Union Européenne (UE) a adopté cette approche réglementaire des cultures génétiquement modifiées en vertu du règlement 1829/2003/CE et de la directive 2001/18/CE. Parmi les pays qui ont adopté une approche réglementaire similaire figurent l'Australie (Gene Technology Act 2000) et la Nouvelle-Zélande (Hazardous Substances and New Organisms Act 1996).

 

Par contre, d’autres pays comme notamment l'Argentine, le Canada et les États-Unis évaluent les risques pour la santé humaine et l'environnement associés à un OGM sur base du produit final plutôt que sur les processus impliqués.

 

La directive 90/220/CEE, abrogée et remplacée par la directive 2001/18/CE, relative à la dissémination volontaire d'organismes génétiquement modifiés dans l'environnement et la directive 90/219/CEE, modifiée par la directive 98/81/CEE et remplacée par la directive 2009/41/CE, sur l'utilisation confinée de micro-organismes génétiquement modifiés (MGM) constituent la base de la réglementation des OGM/MGM en Europe. Les deux textes législatifs ont été adoptés en parallèle en 1990.

 

Les techniques de modification génétique ont évolué à un rythme rapide depuis l'adoption de la législation en 1990, de sorte qu’aujourd’hui, pour certaines techniques, il n'est plus clair si le produit issu de l’application de ces techniques relève du champ d'application de la législation existante sur les OGM/MGM.

 

En effet, les nouvelles techniques du génie génétique aboutissent à la production d’organismes qui :

• Ne contiennent plus aucun matériel génétique provenant d'un organisme avec lequel ils  ne pourraient s'hybrider ou se reproduire naturellement. Le matériel génétique inséré provient donc d’une espèce très proche et sexuellement compatible (cisgenèse).
• Ne contiennent plus du tout de nouveau matériel génétique. L’organisme est modifié en limitant ou inhibant l’expression de certains gènes sans insertion de nouveau matériel génétique dans le génome (genome editing).

 

Dans certains cas, les changements qui en résultent sont similaires à ceux qui peuvent être obtenus avec des techniques de sélection conventionnelles et qui ne relèvent pas du domaine de la législation OGM.

 

Conformément à la législation sur la dissémination volontaire et l'utilisation confinée, un OGM/MGM est défini comme « un organisme/micro-organisme dans lequel le matériel génétique a été modifié d'une manière qui ne se produit pas naturellement par multiplication et/ou par recombinaison naturelle ».

 

Le génie génétique classique est compris comme la possibilité d'apporter des modifications délibérées au matériel génétique qui ne pourraient pas être obtenues par des méthodes de sélection conventionnelles. On peut citer l’insertion de gènes provenant de bactéries conférant une résistance aux herbicides aux plantes transformées.

 

Selon les textes législatifs en vigueur, lorsqu'il s'agit de déterminer si un produit est caractérisé comme OGM ou non, ce n'est pas seulement le processus par lequel une modification génétique est induite qui est d'une importance primordiale. Il est également important que le processus provoque une altération génétique dans l'organisme qui n'aurait pas pu être induite par des méthodes de sélection conventionnelles ou des processus naturels. La définition n'est donc pas seulement liée au processus mais également au produit.

 

Établies il y a plus de 25 ans et basées sur une distinction claire entre les plantes transgéniques et les plantes reproduites de manière conventionnelle, les directives européennes actuelles ne tiennent pas compte du nouveau continuum entre le génie génétique et la sélection conventionnelle. Pour cette raison, un groupe de travail sur les nouvelles techniques (NTWG) composé de représentants de la Commission européenne et des autorités compétentes européennes avait été mis en place. La mission de ce groupe de travail était d’analyser une liste non exhaustive de techniques pour lesquelles il n'est pas clair si elles conduisent à des organismes génétiquement modifiés (1).

Les mutations

Les mutations spontanées sont des phénomènes qui interviennent naturellement dans l’environnement. En trois milliards d'années d'évolution, la nature a produit une panoplie de protéines, simplement par cycles répétés de mutagenèse aléatoire suivies d'une sélection in vivo. Leur existence et les nouvelles caractéristiques qu’elles induisent ont été mises à profit par l’Homme pour identifier les espèces et les variétés de plantes adaptées à ses besoins.

 

A la fin des années 1920 des sélectionneurs ont cherché à augmenter la diversité génétique par divers moyens, dont les mutations « induites » (2, 3). Ces mutations sont provoquées soit par des rayonnements ionisants (rayons X, rayons gamma, UV, les neutrons) soit par des produits chimiques mutagènes appliqués sur des graines en laboratoire. Ces graines sont ensuite semées et les plantes qui en sont issues triées pour les nouveaux caractères recherchés.

 

Les mutations produites par ces procédés physiques peuvent entraîner des pertes de fragments chromosomiques ou des réarrangements dans le génome. Dans le cas des substances chimiques c’est le méthanesulfonate d'éthyle (EMS) qui est le plus souvent utilisé.

 

Ces techniques de mutagenèse, appliquées depuis des décennies et classées comme techniques conventionnelles ou même naturelles, génèrent plusieurs milliers de mutations aléatoires qui sont réparties sur l'ensemble du génome des plantes, dont seule une partie négligeable est responsable des traits recherchés. En effet, l’annexe I B de la directive 2001/18/EC classe la mutagenèse parmi les techniques de modification génétique qui produit des organismes génétiquement modifiés mais qui sont à exclure du champ d’application de la directive. Des variétés aujourd'hui communément acceptées, comme l'orge, le blé, le riz ou le pamplemousse, dont le bien connu Ruby Red (4), ont été modifiés de cette façon. Ainsi sont consommées quotidiennement des cultures « mutées », de fruits, légumes et céréales; des produits qui ne sont pas soumises aux directives européennes (5).

Les mutations induites dirigées par des procédés biotechnologiques : ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9, ODM

Le terme « mutagenèse dirigée » regroupe un ensemble de techniques permettant de créer des mutations à un endroit précis du génome. Ces techniques ne sont donc plus aléatoires comme les premières techniques de génie génétique, où les modifications étaient en grandes parties faites au hasard dans le génome.

 

Deux avancées techniques ont permis la mise au point de ces techniques:

• Le séquençage du génome permettant, à partir des années 1980, de connaître de façon précise les séquences nucléotidiques des gènes, et
• La découverte de « ciseaux » biologiques permettant de couper l’ADN à un endroit précis : les nucléases.

 

Les méganucléases sont des enzymes de restriction modifiées capables de reconnaitre des séquences d’environ 18 nucléotides successifs dans le génome. La probabilité de trouver sur la molécule d’ADN une autre suite de 18 nucléotides étant proche de zéro, cette méganucléase ne coupe l’ADN qu’au site ciblé. Une fois l’ADN coupé, il se répare de façon autonome suivant le même mécanisme que dans le cas des mutations spontanées. Depuis cette découverte, de nouveaux outils de modification génétique ont été utilisés :

• Les ODM (« Oligonucleotide Directed Mutagenesis ») à la fin des années 1990 (6),
• Les nucléases à doigts de zinc (ZFN, « Zinc Finger Nuclease ») au début des années 2000 (7),
• Les nucléases effectrices de type activateur de transcription TALEN (« Transcription Activator-Like Effector Nuclease ») à la fin des années 2000 (8) et,
• Depuis 2012, le système CRISPR/Cas9 (« Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ») (9).

 

Ce dernier est généralement considéré comme unique et flexible en raison de sa dépendance à l'ARN en tant que guide qui dirige la nucléase vers une séquence d'ADN spécifique. Contrairement aux méthodes ZFN et TALEN, qui utilisent des interactions protéine-ADN pour le ciblage, les nucléases du système CRISPR, utilisent les règles d'appariement de bases entre un guide ARN synthétique et la séquence d'ADN cible.

 

Bien que le changement de la séquence génétique de la plante soit provoquée par l’application de techniques d’édition génétique dans le cas des mutations dirigées, il n'y a aucune trace de cette intervention - à l'exception de ces petits remodelages précisément placés, qui engendrent les propriétés désirées. Des gènes ainsi désactivés ont conduit à la résistance à des pathogènes sans avoir recours à des gènes externes (10-12).

 

Les techniques d’édition génétique sont de mieux en mieux maîtrisées et le risque de mutation hors cible devient extrêmement faible, voire nul (13-15). L'apparition de mutations hors cible et donc la création d’effets non intentionnels, est l'un des problèmes cruciaux des techniques d'édition du génome (16). Certaines mutations hors cible sont susceptibles d'entraîner des mutations silencieuses ou de pertes de fonction, d'autres peuvent entraîner une immunogénicité ou une toxicité dans les produits alimentaires en changeant la séquence des acides aminés d’une protéine. Il a également été spéculé que la culture de variétés hébergeant des mutations hors cible pourrait affecter l’écosystème à la suite de croisements.

 

Les preuves et les efforts nécessaires pour évaluer les éventuels effets néfastes sur la santé humaine et animale résultant de modifications non intentionnelles des plantes génétiquement modifiées et des produits dérivés destinés à la consommation humaine ou animale restent un sujet de débat controversé dans certaines juridictions. Un commentaire récurrent est que les modifications non intentionnelles des plantes ne sont pas propres à la modification génétique et que leur évaluation devrait être considérée dans le contexte de celles causées par d'autres méthodes de sélection végétale, telles que la mutagenèse. Certains intervenants se sont donc demandé pourquoi des exigences plus strictes s'appliquaient au génie génétique, étant donné que d'autres techniques de sélection végétale pourraient entraîner des altérations génomiques similaires, voire plus grandes. Au lieu de cela, ils font valoir qu'une législation basée sur les produits permettrait une approche plus cohérente et proportionnée de l'évaluation des risques pour les plantes présentant des caractères nouveaux similaires, quelles que soient les technologies utilisées (17).

 

Une meilleure spécificité peut être obtenue en utilisant des nucléases plus sophistiquées et des molécules de guidage conçues méticuleusement (13, 18, 19). De plus, le séquençage du génome entier peut être utilisé pour identifier la présence d’éventuelles mutations hors cible.

 

Les organismes développés par certaines de ces techniques d’édition génétique ne peuvent donc être distingués au niveau moléculaire de ceux développés par des techniques de mutation « conventionnelles » (utilisant des produits chimiques ou des rayonnements ionisants) ou par sélection dans des populations naturelles (20). Il serait impossible de distinguer entre la mutation survenue de façon naturelle dans le tournesol Clearfield® (21) et la mutation ciblée provoquée dans le colza Cibus® (6).

La décision de le Cour Européenne de Justice

Des associations d'agriculteurs en France ont demandé en 2015 au Premier ministre et au ministre de l'Agriculture, de l'Alimentation et des Forêts d'interdire la culture et la commercialisation de variétés de colza résistantes à des herbicides. Les autorités compétentes françaises ont rejeté la demande à défaut de motivation valable par un refus tacite. Par la suite, les associations d'agriculteurs ont formé un recours devant le Conseil d'État, la plus haute juridiction administrative française contre la décision que des organismes produits par mutagenèse dirigée soient exclus du champ de la directive 2018/18/EC. Le Conseil d'État a décidé de surseoir à une décision et de saisir la Cour européenne de Justice (CEJ) le 17 octobre 2016. La demande de décision préjudicielle se réfère notamment à l'interprétation du concept de mutagenèse au sens de la directive 2001/18/CE sur la dissémination volontaire et à l'applicabilité de la législation à certaines des nouvelles technologies d’édition génétique.

 

Le 25 juillet 2018, la CEJ a finalement statué « que les organismes dérivés de la mutagenèse sont des OGM au sens de la directive 2001/18/EC, car les méthodes et procédés de mutagenèse ne modifient pas naturellement le matériel génétique d'un organisme ». Par conséquent, ces organismes entrent dans le champ d'application de la directive 2001/18/EC et sont soumis aux obligations qui y sont énoncées. Cependant, la directive indique également qu'elle ne s'applique pas aux organismes dérivés de certaines techniques de mutagenèse, celles qui ont été traditionnellement utilisées et qui ont longtemps été considérées comme sûres.

 

Par conséquent, la directive 2001/18/EC s'applique également aux organismes obtenus par des techniques de mutagenèse développées depuis l'adoption de la directive en 2001. Selon la CEJ, les nouvelles méthodes de mutagenèse telles que mutagenèse dirigée (« oligonucleotide directed mutagenesis » ou mutagenèse à l'aide de nucléases ciblées telles que CRISPR/Cas) doivent être différenciées des « méthodes classiques de mutagenèse in vivo » utilisées depuis des décennies. Ainsi, en principe, tous les organismes produits avec les nouvelles techniques développées après 2001 ne relèvent plus de l'exception de mutagenèse de la Directive de 2001/18/CE et sont donc à considérer comme des OGM.

Problèmes d’application de la directive 2001/18/EC aux produits générés par mutagenèse dirigée

La directive 2001/18/EC réglemente la dissémination volontaire dans l’environnement d’organismes génétiquement modifiés ainsi que leur mise sur le marché dans l’Union européenne. Lors de la procédure d’autorisation, ces organismes sont évalués pour déterminer les risques potentiels pour l’environnement et la santé humaine mais doivent également satisfaire aux exigences de traçabilité, d’étiquetage et de surveillance.

 

Si un notifiant/demandeur désire mettre sur le marché une plante hébergeant une mutation ponctuelle et demande une autorisation en accord avec la directive 2001/18/CE, il est tenu de fournir des informations sur la méthode de détection et d'identification de l’OGM. Il serait impossible de surveiller ce produit, et sa mise sur le marché ne serait pas admissible à l'approbation, car le dossier de demande d’autorisation resterait incomplet. D’un autre côté, un OGM illégalement mis sur le marché ne pourrait être détecté. La politique de tolérance zéro pour les OGM non autorisés en UE ne pourrait plus être pleinement appliquée. Des entreprises exportant vers l’UE ont déjà commencé à commercialiser des variétés comportant des mutations ponctuelles induites par les nouvelles techniques de génie génétique (par exemple le colza résistant aux herbicides de la firme Cibus®). Si les semences exportées contiennent de telles graines (ce qui risque de se produire car elles ne sont pas spécifiquement réglementées dans ces pays), ces modifications génétiques induites par les techniques d'édition génomique finiront par entrer dans le pool génétique des lignées produites dans l'UE. L’incapacité à distinguer les variétés éditées de ceux comportant des mutations naturelles s'appliquerait bien entendu aussi aux dispositions sur l'étiquetage ou aux lois nationales.

Détection - étiquetage

Un nouveau défi consiste à savoir quels produits alimentaires sont produits à partir de plantes génétiquement modifiées, quel que soit le degré de modification génétique. Pour les autorités de contrôle, la validation de l'étiquetage des aliments est difficile en raison des difficultés à distinguer entre les mutations issues de l’application des techniques d’édition génétique et les mutations spontanées qui peuvent naturellement se produire dans les plantes.

Arrêt de la Cour Européenne de justice

Dans son arrêt du 25 juillet 2018, la Cour Européenne de justice a défini que les organismes obtenus au moyen de techniques/méthodes de mutagenèse aléatoires, obtenus par des agents mutagènes chimiques ou physiques, doivent être considérés comme étant des OGM au sens de la directive 2001/18 mais sont exclus du champ d’application de cette même directive.

 

Les produits issus de l’application des techniques/méthodes de mutagenèse dirigée impliquant le recours aux techniques qui sont apparues ou se sont principalement développées depuis l’adoption de la directive 2001/18 sont considérés comme des OGM (22). De ce fait, les produits issus de l'application des techniques d'édition du génôme tels CRISPR/Cas, constituent ds OGM.